分蘖洋葱高效再生体系的建立方法与流程

技术领域本发明属于农业生物技术工程领域，具体涉及一种分蘖洋葱高效再生体系的建立方法。

背景技术：

分蘖洋葱(AlliumcepaL.var.multiplcansBaileysyn.var.AgrogatumDon)俗称毛葱、珠葱、分蘖葱头、或埃及洋葱等，为百合科(Liliaceae)葱属(Allium)一年生栽培草本植物，是洋葱的一个变种，体细胞染色体数为2n＝16。原产于中亚细亚和西亚，20世纪初在我国东北地区开始大面积种植，在青海、河北、河南、湖北、四川等地也有小面积种植，且种植面积有扩大的趋势。分蘖洋葱适应性强，高产、耐贮，供应期长，可调剂蔬菜淡季供应，是公认的良好前茬作物。分蘖洋葱有性繁殖困难，植株较难抽薹开花结籽，通常以鳞茎作为繁殖器官，以致单一病毒单独侵染或几种病毒复合侵染所引发的病毒病十分严重。采用组织培养方法可有效地脱除病毒，提高产品的质量和品质。目前分蘖洋葱鳞茎茎尖、鳞茎盘、花蕾、试管苗叶片、假茎等被选作外植体进行愈伤组织诱导和植株再生研究，但丛生芽分化率不高。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明以再生能力较强的分蘖洋葱茎尖为外植体，在消毒、激素浓度、诱导、分化、生根培养基的组成等方面进行优化，以期获得高频再生率的茎尖愈伤组织诱导及植株再生体系，为分蘖洋葱遗传转化提供重要的基础性材料。本发明所述的分蘖洋葱高效再生体系的建立方法，包括以下步骤：(1)分蘖洋葱无菌外植体的获取将分蘖洋葱剥去鳞茎外皮，切除顶部1/2，同时去除根部。流水冲洗40min，于超净工作台上，75％乙醇消毒10秒后用2％次氯酸钠浸泡16min，期间摇荡数次，无菌水清洗3-5次，无菌滤纸吸干，剥取中心1-2mm茎尖。(2)茎尖的愈伤组织诱导将1-2mm茎尖接种于愈伤组织诱导培养基中，人工气候室22～24℃暗培养，每隔15天继代一次；所述的愈伤组织诱导培养基为：MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2.0mg/L2,4-D，高压灭菌前调pH至5.8。(3)愈伤组织丛生芽的分化经过2～3次继代培养后，选取致密、嫩黄的愈伤，切成3mm3小块，接种于分化培养基，置于人工气候室22～24℃，光强2000lx，光照时间12～14h/天；所述的丛生芽分化培养基为：MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA培养基，15天后继代于MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA培养基，高压灭菌前调pH至5.8。(4)再生植株的生根及驯化移栽挑长势旺盛，整齐健壮，颜色浓绿丛生芽，接种于生根培养基，置于人工气候室22～24℃，光强2000lx，光照时间12～14h/天；所述的生根培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，高压灭菌前调pH至5.8。生根培养待试管苗长至8-10cm，根长4-5cm，打开封口膜，加入少量水保湿，在室温下散光炼苗2-3d。将分蘖洋葱植株取出后，清水冲净根部附着的培养基，移栽到灭菌营养土中。置于人工气候室22～24℃，光强2000lx，光照时间12～14h/天。本发明的有益效果是：本发明使用的外植体为分蘖洋葱茎尖，茎尖容易消毒成功，且愈伤组织诱导能力强。培养基所用成分均为常规培养基成分，激素配方简单，成本低。将分蘖洋葱愈伤组织先接种于MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA培养基，15d后继代于MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA培养基，丛生芽分化率可达98％，解决分蘖洋葱丛生芽分化率低的问题。附图说明图1分蘖洋葱愈伤组织诱导培养；图2分蘖洋葱丛生芽分化培养；图3分蘖洋葱生根培养；图4分蘖洋葱再生苗移栽；具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。材料和试剂：本发明所用分蘖洋葱采收于黑龙江省哈尔滨市。MS、1/2MS粉末：青岛高科园海博生物技术有限公司；2,4-D、6-BA、NAA、琼脂：Biosharp；蔗糖：国药集团化学试剂有限公司；营养土：镇江培蕾基质科技发展有限公司。【实施例1】分蘖洋葱无菌外植体的获取8月下旬，将采收的新鲜分蘖洋葱剥去鳞茎外皮，切除顶部1/2，同时去除根部。流水冲洗40min，于超净工作台上，75％乙醇消毒10s后用2％次氯酸钠浸泡16min，期间摇荡数次，无菌水清洗3-5次，无菌滤纸吸干，剥取1-2mm茎尖，备用。【实施例2】分蘖洋葱茎尖的愈伤组织诱导将消毒完毕的1-2mm分蘖洋葱茎尖分别接种于愈伤组织诱导培养基C1-C6，它们共同的成分为：MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，激素的成分和浓度见表1，培养基高压灭菌前调pH至5.8。人工气候室22～24℃暗培养，7天后开始膨大，15天可诱导出愈伤组织，每隔15天继代一次。由表1可见，不同激素处理，愈伤组织诱导率差异显著，30天后在C3：MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2mg/L2,4-D培养基上愈伤组织诱导率最高达99.5％，愈伤组织质地疏松，大颗粒状，颜色为淡黄色或浅绿，如图1所示。表1不同浓度2,4-D和KT对分蘖洋葱愈伤组织诱导的影响表1中愈伤组织诱导率(％)代表平均值±标准误。多重比较采用Duncan法，同列中不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。【实施例3】愈伤组织丛生芽的分化选取经过2～3次继代培养后的致密、嫩黄的愈伤，切成3mm3小块，分别转接到分化培养基Y1-Y12(见表2)，它们共同的成分为：MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，各自6-BA和NAA的浓度见表2，高压灭菌前调pH至5.8。置于人工气候室22～24℃，光强2000lx，光照时间12～14h/天。15天后愈伤组织开始分化绿色芽点。Y8培养基愈伤组织分化绿色芽点率最高为65.3％，丛生芽分化程度较高；Y3培养基愈伤组织分化绿色芽点率虽低46.7％，但丛生芽分化程度高。结合Y8和Y3培养基的优点，将愈伤组织先接种Y8培养基：MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，诱导出绿色芽点，15天后转接于Y3培养基：MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA，15d后可分化出丛生芽，分化率达98％，如图2所示。表2不同浓度6-BA和NAA对分蘖洋葱丛生芽分化的影响表2中愈伤组织分化率(％)代表平均值±标准误。多重比较采用Duncan法，同列中不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。【实施例4】再生植株的生根及驯化移栽选取长势旺盛，整齐健壮，颜色浓绿丛生芽，分别接种于生根培养基R1-R3(见表3)，它们共同的成分为：1/2MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，各自激素的成分和浓度见表3，高压灭菌前调pH至5.8。置于人工气候室22～24℃，光强2000lx，光照时间12～14h/天，生根培养15天后，在3种培养基均有生根现象，但生根率、根形态差异显著。R1培养基生根率最高，可达99.7％，根细长、数目多、植株长势旺盛，如图3所示。表3不同浓度IBA和NAA对分蘖洋葱诱导生根的影响表3中生根率(％)代表平均值±标准误。多重比较采用Duncan法，同列中不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。在R1中生根培养，待试管苗长至8-10cm，根长4-5cm，打开封口膜，加入少量水保湿，在室温下散光炼苗2-3天。将分蘖洋葱植株取出后，清水冲净根部附着的培养基，移栽到灭菌营养土中。置于人工气候室22～24℃，光强2000lx，光照时间12～14h/天，移栽存活率100％。